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1. 預(yù)期用途

用于 HPV 16 型 (HPV16) DNA 的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)基于核酸的測(cè)定由冷凍干燥的制備物組成含有全長(zhǎng) HPV16 DNA 的重組質(zhì)粒 pBR322 被克隆通過(guò)其獨(dú)特的 BamH1 站點(diǎn) (Quint et al., 2006)。該標(biāo)準(zhǔn)已在純化的人類基因組 DNA 的背景下配制，凍干在 0.5 ml 等分試樣中并儲(chǔ)存在 -20 °C。材料經(jīng)過(guò)校準(zhǔn)涉及 19 個(gè)實(shí)驗(yàn)室的國(guó)際合作研究（Wilkinson 等人，2010）。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)包含的材料是專有的第三方，應(yīng)僅用于內(nèi)部校準(zhǔn)或HPV-16擴(kuò)增檢測(cè)的工作標(biāo)準(zhǔn)脫氧核糖核酸。國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)不應(yīng)用于任何其他用途，使用后應(yīng)丟棄。

2. 注意
NIBSC 06/202 人乳頭瘤病毒16 型(標(biāo)準(zhǔn)品）不適用于人類食物鏈中的人類或動(dòng)物。

該材料含有源自 C33A 細(xì)胞的 DNA。與所有生物來(lái)源的材料一樣，這種制劑應(yīng)被視為對(duì)健康有潛在危害。應(yīng)根據(jù)您自己實(shí)驗(yàn)室的安全程序使用和丟棄它。此類安全程序應(yīng)包括戴防護(hù)手套和避免產(chǎn)生氣溶膠。打開安瓿或小瓶時(shí)應(yīng)小心謹(jǐn)慎，以免割傷。

3. 單元

HPV16 DNA 的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（NIBSC 代碼 06/202）已規(guī)定為每安瓿 5 x 10^6 國(guó)際單位 (IU) 的單位。

可追溯性聲明：

在 2008 年 1 月的一次 WHO 會(huì)議上（WHO 會(huì)議報(bào)告，2008 年）提出，HPV16 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的使用說(shuō)明包括用于確定所用散裝材料的理論 HPV16 基因組當(dāng)量 (GEq) 的計(jì)算和假設(shè)在制定國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，證明 1 IU 相當(dāng)于 1 GEq 用于 HPV16 DNA。因此，第一個(gè) WHO HPV16 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)的最終統(tǒng)一仍然是 IU，而可追溯性聲明將允許用戶將 IU 等同于 GEq。

在新墨西哥大學(xué) (UNM) 的 Cosette Wheeler 博士的實(shí)驗(yàn)室中進(jìn)行了重組 HPV16 質(zhì)粒儲(chǔ)備制劑的 DNA 濃度測(cè)定。 DNA濃度通過(guò)260 nm處的吸光度以及使用Picogreen測(cè)定法（Invitrogen Corporation，USA）的分光熒光法測(cè)定。在兩次 DNA 測(cè)量之間獲得了 0.95 或更高的相關(guān)系數(shù)。將 10 ng HPV16 質(zhì)粒 DNA/μl 提供給 NIBSC 用于配制用于隨后冷凍干燥的散裝材料。 UNM 實(shí)驗(yàn)室還向 NIBSC 提供了一份聲明，表明 HPV16 的 1.0 x 1011 GEq/ml 等于 1.17 ng/μl。因此，10 ng HPV-16 質(zhì)粒 DNA/μl 質(zhì)粒儲(chǔ)備液相當(dāng)于 8.547 x 1011 HPV-16 GEq/ml。 NIBSC 在制定第一國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)時(shí)使用了這些數(shù)據(jù)

用于 HPV 16 型 DNA。

用于 HPV 16 型 DNA 的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（NIBSC 代碼 06/202）的散裝材料配方：

在 NIBSC，根據(jù)公式制備大量 HPV16 質(zhì)粒 DNA 材料：

HPV GEq/ml 散裝材料 = (HPV GEq/ml 質(zhì)粒原液 x 體積質(zhì)粒原液)/體積散裝材料。

因此，HPV16 GEq/ml 散裝材料 = (8.547 x 1011 HPV-16 GEq/ml 質(zhì)粒原液）x（0.02223 ml HPV-16 質(zhì)粒原液）/1900 ml HPV-16 散裝材料 = 1.0 x 107 HPV-16 GEq/ml散裝材料 HPV-16 DNA 散裝材料隨后以 0.5 ml 等分試樣冷凍干燥。

第一次將 IU 等同于 GEq 需要某些假設(shè)HPV16 DNA 的國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)：

1) HPV16 的 1.0 x 1011 GEq/ml 等于 1.17 ng/μl。

2) 凍干后 HPV16 DNA 的活性沒有損失。

3) 重組HPV-16質(zhì)粒DNA準(zhǔn)確模擬了生物樣本中HPV16病毒DNA的活性。

獨(dú)立計(jì)算重組 HPV-16 質(zhì)粒的 GEq/ml脫氧核糖核酸。

NIBSC 還使用 BioEdit 序列比對(duì)編輯器 v7.0.5.3 (Tom Hall, Isis 制藥公司，美國(guó)）。用于確定分子量的序列是用于 pBR322 的 GenBank 登錄號(hào) J01749.1 和用于 HPV16 的參考序列（登錄號(hào) K02718）。

NIBSC 06/202 人乳頭瘤病毒16 型(標(biāo)準(zhǔn)品）

生物編輯數(shù)據(jù)DNA分子：HPV16 Accession K02718

長(zhǎng)度 = 7904 個(gè)堿基對(duì)

MW= 4786756.00 道爾頓，雙鏈

DNA分子：克隆載體pBR322

長(zhǎng)度 = 4361 個(gè)堿基對(duì)

MW= 2653867.00 道爾頓，雙鏈

公式 HPV 質(zhì)粒原液的 GEq/ml 根據(jù)公式計(jì)算：

HPV 質(zhì)粒原液的 GEq/ml = (HPV 質(zhì)粒原液的 DNA 濃度) x (HPV DNA 的 MW + pBR322 的 MW)-1 x (阿伏伽德羅數(shù)) 其中阿伏伽德羅數(shù) = 6.022x1023 分子/mol

根據(jù)以下公式計(jì)算大量 HPV DNA 材料的 GEq/ml：

HPV GEq/ml 散裝材料 = (HPV GEq/ml 質(zhì)粒原液 x 體積質(zhì)粒原液)/體積散裝材料。

計(jì)算 將重組 HPV16 質(zhì)粒原液以 10 ng/μl 的濃度提供給 NIBSC。

使用上面顯示的 MW 測(cè)定，HPV16 質(zhì)粒原液的 GEq/ml 為：

= (10 x 10-9

g/μl) x (mol/(7440623 g) x (6.022x1023 分子/mol)

= 8.093 x 108 分子/μl

= 8.093 x 1011 分子/毫升

= 8.093 x 1011

HPV16 GEq/ml

將 22.23μl 重組 HPV16 質(zhì)粒原液稀釋至終體積為 1900ml，因此，HPV-16 GEq/ml 散裝材料 = (8.093 x 1011 HPV16 GEq/ml 質(zhì)粒原液) x (0.02223 ml HPV16 質(zhì)粒原液) / 1900 ml HPV16 散裝材料 = 0.947 x 107 HPV16 GEq/ml 散裝材料

4. 內(nèi)容

生物材料原產(chǎn)國(guó)：英國(guó)。

每個(gè)安瓿含有相當(dāng)于 0.5 ml HPV16 的凍干粉

質(zhì)粒 DNA 在 10mM Tris 緩沖液 pH7.4 中含有 1mM EDTA、5 mg/ml 海藻糖和 ~1 x 106 人 Geq/ml 源自 C33a 細(xì)胞。

5. 存儲(chǔ)

收到時(shí)，安瓿瓶應(yīng)存放在 -20 °C 或以下。

請(qǐng)注意：由于凍干材料固有的穩(wěn)定性，NIBSC 可能會(huì)在環(huán)境溫度下運(yùn)輸這些材料。

6. 開瓶指南

DIN 安瓿瓶有一個(gè)“易開”顏色的壓力點(diǎn)，窄的安瓿桿在此與較寬的安瓿瓶主體相連。各種類型安瓿破膠劑是市售的。打開

安瓿，輕輕敲擊安瓿以收集底部（標(biāo)記）端的材料，并按照安瓿破碎機(jī)提供的制造商說(shuō)明進(jìn)行操作。

NIBSC 06/202 人乳頭瘤病毒16 型(標(biāo)準(zhǔn)品）

7. 材料的使用

在重新配制之前，不應(yīng)嘗試稱量?jī)龈刹牧系娜魏尾糠帧?/p>

HPV16 DNA 的第一個(gè)國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)包含高拷貝數(shù)模板。 HPV16質(zhì)粒的風(fēng)險(xiǎn)很高

打開玻璃安瓿時(shí)通過(guò)霧化造成 DNA 污染。材料必須在單獨(dú)的實(shí)驗(yàn)室環(huán)境中打開和處理，遠(yuǎn)離試劑、實(shí)驗(yàn)室器具和樣品等其他預(yù)放大組件。

該材料以凍干形式提供，使用前應(yīng)在 0.5 ml 無(wú)菌無(wú)核酸酶水中復(fù)溶。確保安瓿的內(nèi)表面被添加的水潤(rùn)濕，以便重組粘附在玻璃上的任何凍干材料顆粒。

重組材料的最終濃度為 1 X 10^7 IU/mL。

重組材料適用于校準(zhǔn)內(nèi)部或工作標(biāo)準(zhǔn)，以擴(kuò)增和檢測(cè) HPV16 DNA。該材料不適用于校準(zhǔn)或評(píng)估提取、沉淀或離心程序。 NIBSC 可以為在提取步驟無(wú)法與擴(kuò)增步驟分離的分析中使用 HPV16 DNA 國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)（例如進(jìn)樣、應(yīng)答平臺(tái)）提供指導(dǎo)。該材料未針對(duì)人類 DNA 核酸擴(kuò)增技術(shù)進(jìn)行校準(zhǔn)。